PiggyBac質(zhì)粒基因表達載體系統(tǒng)利用LoxP-Stop-LoxP（LSL）表達盒，在哺乳動物細胞和動物體內(nèi)實現(xiàn)Cre介導的條件性基因激活表達。LSL表達盒包含三個重復的SV40 polyA，序列兩端為LoxP位點。用戶選擇的啟動子位于LSL表達盒的上游，而用戶感興趣的基因位于其下游。在Cre重組酶不存在的情況下，該表達盒完全阻斷了目的基因的正常表達；當將Cre引入攜帶該載體的細胞中時，目的基因上游的LSL表達盒將會被刪除，從而目的基因能夠在用戶選擇的啟動子下被永久激活表達。

該載體不僅適用于體外細胞培養(yǎng)，更適用于轉(zhuǎn)基因動物模型的構(gòu)建。當攜帶這種載體的轉(zhuǎn)基因動物與攜帶組織特異性表達Cre的轉(zhuǎn)基因動物雜交時，產(chǎn)生的動物后代將在特定的細胞中組織特異性表達Cre，從而啟動目的基因在該特定細胞中組織特異性表達。

在細胞培養(yǎng)中使用該載體系統(tǒng)時，可將抗生素或熒光標記添加到載體中，使轉(zhuǎn)染后的細胞可被篩選或可示蹤以便于分離出已永久整合載體的細胞。

PiggyBac系統(tǒng)包含兩個組分，一個組分為PBase轉(zhuǎn)座酶（通常為表達PBase的IVT mRNA）；另一個組分被稱為轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，包含兩個末端重復序列（TR）以及兩者之間的被轉(zhuǎn)座區(qū)域，需要被轉(zhuǎn)座到宿主基因組中的目的基因就克隆在這個區(qū)域。

當表達PBase的IVT mRNA和轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染靶細胞時，PBase IVT mRNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶將會識別轉(zhuǎn)座子的兩個TR元件，然后將被轉(zhuǎn)座區(qū)和兩個TR元件插入到宿主基因組中。轉(zhuǎn)座插入通常發(fā)生在包含TTAA序列的宿主染色體位點，并在轉(zhuǎn)座子兩側(cè)出現(xiàn)TTAA重復序列。

PiggyBac屬于II類轉(zhuǎn)座子，通過“剪切—粘貼”的機制移動，從一個地方轉(zhuǎn)座到另一個地方，而不留下序列本身（恰好相反，I類轉(zhuǎn)座子是通過“復制—粘貼”的方式移動）。由于輔助質(zhì)粒是通過瞬時轉(zhuǎn)染進入宿主細胞的，故會逐漸丟失。隨著輔助質(zhì)粒的丟失，轉(zhuǎn)座子在宿主基因組中變成了永久整合。當這些宿主細胞再次被輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，整合的轉(zhuǎn)座子會再次通過“剪切—粘貼”的機制移動。

關(guān)于該載體系統(tǒng)和Cre介導重組的更多信息，請參考以下文獻。

該載體是為在哺乳動物細胞和動物體內(nèi)實現(xiàn)Cre介導的條件性基因表達而設(shè)計的。目的基因的表達最初是沉默的，但通過與Cre重組酶的共表達后，目的基因上游的3x SV40 pA將會刪除，從而目的基因能夠在用戶選擇的啟動子下被永久激活表達。

基因的穩(wěn)定激活：經(jīng)過Cre重組酶處理后，阻斷下游基因轉(zhuǎn)錄的3x SV40 pA將被永久刪除，隨后客戶選擇的啟動子能夠驅(qū)動的目的基因的正常表達

外源基因的永久整合：常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染只能實現(xiàn)外源基因的瞬時表達，這種外源基因會隨著宿主細胞的分裂而不斷丟失，在快速分裂的細胞中顯得尤為顯著。相反，將PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體和輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中，由于轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的作用下，目的基因能穩(wěn)定地整合到宿主細胞的染色體中，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)座子載體上攜帶的目的基因在宿主細胞中永久表達。

技術(shù)簡單：通過常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，相比起病毒載體需要進行病毒包裝，過程更簡單。

載體容量大：我們的轉(zhuǎn)座子載體總?cè)萘靠蛇_30 kb，其中質(zhì)粒骨架只占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

轉(zhuǎn)染細胞類型受限：PiggyBac載體進入細胞依賴于轉(zhuǎn)染。不同類型的細胞，其轉(zhuǎn)染效率差異非常大。非分裂細胞通常比分裂細胞更難轉(zhuǎn)染，原代細胞比永生化細胞更難轉(zhuǎn)染，一些重要的細胞類型轉(zhuǎn)染難度更大，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染主要局限于體外應用，很少應用于體內(nèi)實驗（但可以應用于轉(zhuǎn)基因動物模型制備）。以上因素在一定程度上制約了PiggyBac系統(tǒng)的應用。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transpose can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

Promoter: The promoter that will drive expression of your gene of interest after treatment with Cre recombinase.

LoxP: Recombination site for Cre recombinase. When Cre is present the region flanked by the two LoxP sites will be excised.

3x SV40 late pA: Repeats of the simian virus 40 late polyadenylation signal. This terminates transcription, preventing expression of the downstream gene of interest prior to excision with LoxP-flanked region with Cre.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

rBG pA: Rabbit β-globin polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.